科研 香港中文大学：红杆菌科Rhodobacteraceae的种群分化与珊瑚区室相关（国人佳作）

  珊瑚的黏液、组织和骨架组成了不同的微生物群，但这些珊瑚区室如何塑造微生物的进化仍未探究。本文以珊瑚Platygyra acuta及Rhodobacteraceae为研究对象，从3个珊瑚区室（粘液、骨骼和组织），分离出Rhodobacteraceae的2个谱系，一个是普遍与珊瑚有关的Ruegeria（20个分离株），另一称作Rhodobacteraceae（214个分离株），并对234株细菌分离株进行了全基因组测序。

  根据结果得出定殖在珊瑚中的2个不同种群分化成粘液和骨骼两个分支，clade-M和clade-S。clade-M具有利用富含黏液的珊瑚渗透压物质（如甲胺类、DMSP、牛磺酸、L-脯氨酸等）的功能， clade-S独特地具有促进低能、日缺氧骨架适应（如硫氧化、游泳运动等）的特性。而珊瑚区室的异质性驱动了细菌的群体进化，分离自不同海洋环境的细菌扩展分析也证实了这一观点。Slatkin-Maddison试验表明珊瑚区室间扩散限制是微生物种群多样化的一个关键机制。综上，研究结果表明，不同的珊瑚区室代表着不同的生态和微观环境上分开的生境，这些生境驱动着珊瑚微生物的进化。

  系统发育树显示，从Ruegeria珊瑚种群中分离到的20株关系紧密的P. acuta形成三个分支（图1A）。其中，从骨骼中分离出6个clade-S成员，6个clade-M成员除1个成员从周围海水中采集，其余均从粘液中采集（图1A）。外群分支由7个骨骼相关菌株和1个组织相关菌株组成。因为这些菌株是从同一珊瑚种群中分离出来的，对任何菌株水平的基因组差异的解释都排除了寄主物种的影响。因此，我们根据来源区室的系统聚类表明，对不同珊瑚区室的适应可能推动了Ruegeria种群的进化多样性。

  我们进一步研究了这20个菌株的ANI和16S rRNA基因同一性，这是通常用于细菌种类划分的标准方法。基于ANI或16S rRNA基因的遗传聚类群与系统发育聚类一致（图1B）。在每个分支中，ANI和16S rRNA基因同一性都高于通常用于描述细菌物种的水平，分别为95.0%和98.7%。在clade-M和clade-S之间，ANI低于89.9%（表1，图1B），但16S rRNA基因的平均同源性大于99.7%（表1，图1B）。考虑到16S rRNA基因没有在物种水平上提供足够的分辨率，我们假设每个分支可能代表一个独特的物种，物种形成过程可能已完成。我们对这一假设来测试，如下所示。

  图1Ruegeria种群的系统发育和种群分化。（A）从珊瑚物种中分离出的20个菌株的最大似然系统发育树（登记号见表S6）。这棵树用点生根法绘制。节点处的实心圆圈表示分支的支持值为100%。clade-M的生命周期评价、clade-M内五个粘液菌株的生命周期评价和clade-S的生命周期评价分别显示为蓝色三角形、红星和粉色三角形。从不同珊瑚区室分离的菌株以不一样的颜色突出显示。clade-M和clade-S也被标记。（B）20个菌株全基因组平均核苷酸同一性热图和16S rRNA基因成对同一性热图。（C）来自clade-M和clade-S的12个分离株的精细结构共同化学矩阵，较暖的颜色代表相比之下，菌株之间共享的更多祖先。分配给同一fineSTRUCTURE群体的菌株与矩阵左侧的竖条相连，树形图显示fineSTRUCTURE群体的聚类。（D）通过Jaccard距离测量的附属基因含量相似性的热图，较暖的颜色代表菌株之间较高的相似性。基于完全连锁聚类方法生成左树图。

  系统发育树的分支模式不能总是代表群体结构，因为重组的速度和影响可能会显著影响细菌的进化。为了阐明种群细分是否发生在clade-M和clade-S之间，我们采用fineSTRUCTURE v2.0.7进行两个分支的核心基因组比对。来自clade-M和clade-S的12个菌株被分成7个亚群，3个在clade-S中，4个在clade-M中（图1C）。每个分支的共同祖先比例远大于分支之间的比例（图1C），这表明两个分支之间的同源重组存在强大的屏障。共生化种群和系统发育群之间总体一致的分支模式表明clade-M和clade-S分化为两个物种。与分支内的基因流相比，分支间减少的基因流还通过两个分支之间减少的ρ/θ比和r/m比得到支持 (附文本2.1, 表S1)。此外，Fst(种群分化的衡量指标)在整个核心基因组中进行了估算，全基因组Fst值较高(≥0.5)，表明两个进化支之间的物种形成接近完成（图S2，附文本2.1）。

  核心基因组区域与远缘谱系的重组可能是驱动玫瑰杆菌种群分化的关键机制。这种等位基因替换预计将在受影响基因中基本上中性的同一位点留下核苷酸替换率的强信号。我们最近开发了一个分析流程，通过对所有可能的基因组对之间的dS值进行聚类，并跨越所有共享的单拷贝基因家族，提取出其中的基因座。该过程由167个单拷贝基因家族组成的异常聚类的识别，每个家族显示异常大的分支间dS值（表S2，图2）。新等位基因替换这些位点有几率发生在clade-M （在图1A中用蓝色三角形标记）或clade-S（在图1A中用粉红色三角形标记）的最后一个共同祖先（LCA）上，等位基因替换推断的进化史将在以下章节中讨论（图S4，图S5-S11）。

  上述分析证明了核心基因组中，clade-M和clade-S的遗传分离现象。我们进一步研究群体分化是否也发生在附属基因组中（不是所有clade-M和clade-S成员共享的基因）。基于基因存在/缺失模式的聚类谱系图（图1D）显示，每个分支内的附属基因含量相似性高于分支间的相似性。基因含量树图（图1D）和基于核心基因的系统发育树（图1A）之间的分支模式一致表明，群体分化发生在附属基因组上。在3202个附属基因家族中，有194个和157个家族都会存在于分支机构成员中。使用“分支特异性基因家族”的宽松定义，其中至少三分之二的基因存在于一个分支菌株中，不超过三分之一的菌株存在于其他分支中，我们得知了536和365个对clade-M和clade-S特异的基因家族（表S3，表S4和图2），表明这两个分支在许多分支特异性功能中具有多样性。

  在上述原则的指导下，我们推断基因家族的进化历史。对于536个clade-M特异性基因，我们推断，LCA中的224个基因家族在clade-M的生命周期评价中获得，64个基因家族在clade-S的生命周期评价中丢失（表S3）。由于clade-M的基础生态位被海水菌株占据（图1A），我们进一步推断，LCA中有122个附属基因家族增加发生（图1A中用红星标记）。对于365个clade-S特异性基因，推断在LCA中分别有233个基因家族在clade-S特异性基因的生命周期评价中获得，97个基因家族在clade-M特异性基因的生命周期评价中丢失。因此，基因的增加和丢失可能在附属基因组的区分中起了及其重要的作用。在901个分支特异性基因家族中，126个与基因组岛（GIs）相关（图2），表明GIs可能促进了群体分化。在接下来的章节中，我们详细阐述了可能感兴趣的一些分支特异性基因功能及它们在促进群体分化中的潜在作用。

  种群的系统发育树和泛基因组。基因家族按照菌株HKCCD4315的封闭基因组顺序排列。圆形轨迹描绘了基因组，这些基因组按照系统发育的顺序排列，并以灰色显示。从内到外：（1）-（6）clade-M的6个基因组。（7）-（12）LCA的六个基因组在clade-S生命周期评价中获得的基因显示为洋红色，在clade-M的生命周期评价中丢失的基因显示为橙色。（13）-（20）外群的八个基因组。536个clade-M特异性基因和365个clade-S特异性基因在所有轨迹中以黄色显示。基因组岛（GIs）在所有轨迹中以深灰色显示。其他基因在所有的轨迹中都以浅灰色显示。（21）染色体的基因组区域和三个质粒显示为灰色，显示异常大的同义替换率（

  一系列化学相关的甲胺，如甘氨酸甜菜碱（GBT）、胆碱-硫酸氧（COS）、甘油磷酸胆碱（GPC）、胆碱和肌氨酸，与溶质相容，被检测为包括珊瑚在内的刺胞动物的细胞成分。其中，GBT是珊瑚中最普遍的渗透压调节剂。不同珊瑚物种的GBT浓度从19至130 mmol/L 不等，占检测到的浓度的90%，在一些富含GBT的珊瑚中，相容溶质占总氮储存量的16%。另外两种甲胺，三甲胺氮氧化物（TMAO）和二甲基甘氨酸（DMG），也是海洋渗透剂，可以从胆碱和GBT转化而来（图3），但在珊瑚研究中没有报告。

  许多clade-M特异性基因可能参与了这种甲胺的利用。甲胺能够最终靠多种转运蛋白转运到细菌细胞质中。例如，GBT可能通过ABC转运蛋白ProVWX被接收。GBT前体，GPC和胆碱，可能分别通过ABC转运蛋白UgpABCE和BCCT转运蛋白BeT被同化。clade-M成员特别包含所有三种转运蛋白的额外拷贝（表S3，图3）。在进入细胞质后，GBT、GPC和胆碱的代谢途径在很大程度上重叠 （图3）。胆碱要么掺入磷脂酰胆碱（PC），要么进行脱甲基降解。对于前者，编码胆碱激酶（cki1，表S3）的同化关键基因对clade-M是特异性的。对于后者，胆碱在去甲基化前被有氧氧化为GBT （图3）。包括胆碱脱氢酶 （betA，表S3）和甜菜碱醛脱氢酶（betB，表S3）在内的关键基因是clade-M特异性基因的一部分（图3）。

  Roseobacter的模式菌株，Ruegeria pomeroyiDSS-3，先前显示降解GBT并依次产生中间代谢物，包括DMG、肌氨酸和甘氨酸。这种典型途径允许玫瑰杆菌利用GBT作为碳、氮和能量来源（图3，位于GBT下游的右路径）。它始于甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶（bhmt）催化GBT去甲基化形成DMG的（图3）。然而，在目前Ruegeria亚群体中，一个截短的bhmt基因（HKCCD4315_03106）存在于核心基因组中，缺乏维生素B12结合结构域。这种截短的bhmt也在Roseobacter组成员Phaeobacter inhihens（五倍子Phaeobacter gallaeciensis）中被鉴定，并且被认为对该反应无功能，因为该细菌很少使用GBT作为碳源。同样，在此分析的六个分离株中没有一个能够以胆碱或GBT作为唯一的C和N 来源（图4A-2，4A-3）或作为唯一的C来源（图4B-3，4B-5）茁壮成长。当在GBT下游提供中间代谢物时，例如DMG（图4A-4）和肌氨酸（图4A-5），这些分离物茁壮成长，进一步支持GBT的利用在BHMT催化的步骤被阻断。具体来说，DMG通过二甲基甘氨酸脱氢酶（dmgdh）脱甲基化为肌氨酸，肌氨酸能够最终靠肌氨酸脱氢酶（sardh）或肌氨酸氧化酶（soxABDG）脱甲基化为甘氨酸。肌氨酸也连接到另一个珊瑚渗透电解质肌酸；虽然肌酸不是GBT的下游代谢产物，但它通过肌酸酶（cre）水解为肌氨酸和尿素，产物分别遵循肌氨酸去甲基化途径和尿素解（ureABCDEF）（图3）。

  图3Ruegeria种群中甲胺相关珊瑚渗透物质的分解代谢途径。实线箭头代表Ruegeria群体中存在的基因。虚线中的箭头代表Ruegeria群体中缺失的基因。青色箭头代表clade-M特异性基因。绿色箭头表示异常核心基因，显示异常大的分支间dS值。clade-M和clade-S的LCA发散等位基因替换分别用实心绿色和红色圆圈标记。绿色的空心圆圈代表分支内的多个等位基因替换。黑色圆圈表示等位基因替换历史不能基于可用数据来进行解析。黑色箭头显示了所有clade-M和clade-S成员共享的核心基因。红色箭头表示与氮同化有关的反应。黄色箭头表示与碳同化有关的反应。在这些途径中未曾发现分支特异性基因。图中只显示了混杂转运蛋白的主要底物。

  另一方面，所有分析的分离株都能够正常的使用胆碱（图4B-4）和GBT（图4B-6） 作为唯一的氮源，这表明它们能通过替代途径从胆碱和GBT获得氮。一种可能性是GBT最初转化为三甲胺（TMA），其可以用作唯一的氮源（图4B-8）。这种反应在肠道微生物群的代谢组学研究中得到证实，但遗传基础尚不清楚（图3）。TMA能够最终靠二甲胺/三甲胺脱氢酶（dmd-tmd），依次脱甲基为二甲胺（DMA）和一甲胺（MMA）。然后MMA被进一步氧化，通过包含320γ-谷氨酰甲基酰胺合成酶（gmaS）、N-甲基谷氨酸合酶（mgsABC）的途径释放铵N-甲基谷氨酸脱氢酶（mgdABCD）。TMAO是另一种与胆碱化学相关的甲胺渗透压调节剂。可通过厌氧二甲基亚砜/三甲胺氧化物还原酶（dmsABC）或需氧蛋氨酸亚砜还原酶（yedYZ）还原为TMA，然后进入TMA去甲基化途径（图3）。

  虽然上述涉及甲胺相关渗透剂的基因是Ruegeria群体所有成员共有的，但它们中的许多至少有一个额外的拷贝对clade-M成员是特异的。后者包括用于GPC摄取的ugpABCE、用于胆碱获取和分解代谢的betABT和cki1、用于GBT摄取的proVWX、用于将肌酸转化为肌氨酸的cre、用于肌氨酸去甲基化的sardh和soxABDG，以及用于MMA氧化的gmaS和mgsABC（图3）。这些基因的大部分被推断为在clade-M的LCA获得（23个中的12个）或在clade-S的LCA丢失（23个中的4个），而剩余的基因是在5个clade-M粘液成员的LCA获得的（23个中的7个）。在核心基因拷贝中，ugpABE、betA、dmgdh和dmsABC经历了新的等位基因替换，尽管每个基因簇中的不同组成基因经历了不同的同源重组进化史（图3，表S5）。根据这个在遗传水平上的分支间差异，clade-M在利用珊瑚中丰富的渗透物质方面表现出明显高于clade-S的能力，例如使用胆碱（p 0.05，单向重复测量方差分析；除非另有说明，以下使用的测试相同；图4B-4）和GBT（图4B-6）作为唯一的N源，并使用肌氨酸和肌酸作为唯一的N和C源（图4A-5和4A-8）。虽然珊瑚（例如DMG、TMA和TMAO）也使用渗透物质，但在个clade-M和clade-S之间没有观察到显著差异（图4A-4、4B-8和4B-10）。

  综上所述，上述基因与甲胺相关渗透调节物质的代谢有关，并且它们中的大多数在clade-M和clade-S的LCA上经历了基因拷贝数变异或新的等位基因替换。因此，我们提出在利用甲胺相关珊瑚渗透调节物质中遗传性状的获得有助于clade-M和clade-S的多样化。

  图4 三个clade-M杆菌菌株和三个clade-S杆菌菌株的生长试验。（A）基本培养基辅以不同的基质。（1）对照实验。在阴性对照中，细菌在没有碳源和氮源的基本培养基中培养。在阳性对照中，细菌在富含培养基中培养，培养基中添加蛋白胨、葡萄糖和酵母提取物作为混合碳源和氮源（空心三角形）。这六个菌株在5 mM胆碱（2）、GBT （3）、DMG （4）、肌氨酸（5）、TMA （6）、TMAO （7）、肌酸（8）、L-脯氨酸（9）、牛磺酸（10）和尿素（11）上的生长实验，每个实验用作唯一的C和N源（实心三角形）。对每个条件进行三次重复。（B）不同的底物被用作唯一的碳源或唯一的氮源。（1）对照实验。在阴性对照中，细菌在不添加碳源和氮源的最小培养基中培养（空心圆圈）。在阳性对照中，分别使用丙酮酸作为碳源和铵作为氮源培养细菌 （空心三角形）。六个菌株在5 mM的DMSP （2）、胆碱（3）、GBT （5）、TMA （7）、TMAO （9）和尿素（11）上的生长实验，每个菌株以铵（10 mM）作为N源（实心三角形）。以5

  胆碱（4）、甘氨酸甜菜碱（6）、TMA （8）、TMAO （10）和尿素（12）为唯一氮源，以丙酮酸盐（5 mM）为碳源（实心三角形）进行6个菌株的生长试验。每个条件下进行三次重复。

  在本文，我们强调了另外三种珊瑚渗透剂，它们将clade-M和clade-S区分开来：L-脯氨酸、DMSP和牛磺酸。L-脯氨酸是转运蛋白ProVWX和BetT的潜在底物，与胆碱和GBT相比亲和力相对较低。这得到了生长试验的支持，其中clade-M成员在利用L-脯氨酸时表现出明显高于clade-S成员的生长产量和生长速率（图4A-9）。DMSP能够最终靠脱甲基或裂解途径降解，分别产生甲硫醇（MeSH）和二甲基硫醚（DMS）作为最终产物。去甲基化途径由dmdABCD催化，只在clade-M成员中发现，推断在clade-M的生命周期评价中获得（表S3）。切割途径由许多非同源基因介导，其中dddP（表S3，图2）仅存在于clade-M的LCA成员的质粒中，dddD（表S5）是显示分枝间dS值异常大的的异常核心基因的一部分，尽管根据我们的系统发育分析 （图S4对图S6）不清楚新dddD等位基因的供体。使用DMSP作为唯一的碳源，clade-M成员比clade-S成员积累高生长产量（图4B-2）。就牛磺酸而言，编码牛磺酸转运蛋白（tauABC）的基因是异常核心基因的一部分枝间dS值较大（表S5）。系统发育分析显示了三组基因的独立的个进化史（图S4对比图S7）。例如，tauC系统发育表明五个clade-M粘液成员（在图1A中用红色星标记）的LCA经历了发散等位基因替换，而tauA系统发育表明海水菌株（HKCCD6109）和clade-S是新等位基因的受体。值得注意的是，在6个clade-M成员中的4个发现了tauABC基因的第二个拷贝。这些遗传差异再次得到生长试验的支持，其中clade-M成员与clade-S成员相比，在利用牛磺酸作为唯一的碳和氮来源方面显示出显著更高的生长产量（图4A-10）。上述基因中的大部分是在clade-M的生命周期评价中获得的（11个中的7个），其余4个基因是在clade-M的4个成员的生命周期评价中获得的（表S3），进一步支持了珊瑚渗透剂的利用可能是clade-M细菌的生态适应。

  除了渗透调节物质的利用，clade-M还获得了与使用其他相关底物（即碳水化合物和芳香化合物，补充文本2.3）相关的基因，以及参与群体感应（QS）系统和生物膜形成的基因（补充文本2.4），这可能进一步促进clade-M成员适应营养丰富和密集的珊瑚粘液生境。

  Roseobacter成员通常通过sox和cox基因簇分别氧化还原硫和一氧化碳来保存能量。我们在clade-S的所有成员中发现了一个完整的sox基因簇，但是在clade-M只有一个菌株（HKCCD4884）（表S4），推断这个sox基因簇在clade-M的LCA成员中丢失。此外，两个编码I型 （HKCCD4315_03676-03684）和II型（HKCCD4315_03987-03970）一氧化碳脱氢酶（codh）的cox基因簇被两个clade家族共享。其中，一氧化碳氧化不可或缺的I型cox基因簇，显示了异常大的分支间dS值，表明两个分支间一氧化碳氧化的基因组起源不同。构成I型cox簇的基因系统发育树显示，clade-S的LCA在cox基因簇中经历了不同的等位基因替换（图S4对图S8）。加上sox基因簇的存在，clade-S成员似乎使用了更通用的节能策略来适应能量有限的珊瑚骨骼生态位。

  共生和岩内藻类在白天光合作用产生的溶解氧通过呼吸作用被全生物成员持续消耗，使骨骼成为全缺氧环境。一直以来，clade-S在LCA获得了一个基因簇（frdABCD和ttdAB，表S4），这可能使与骨架相关的菌株能够在缺氧条件下呼吸富马酸盐和酒石酸盐。此外，允许二甲基亚砜（DMSO）和TMAO无氧呼吸的基因簇显示异常大的dS值（补充文本2.5，图S9）。这些化合物可以作为全缺氧骨架中能量守恒的末端电子受体。

  细菌可以以多种方式运动，其中游泳运动使细菌能够在液体中移动，而群集和蹭行使细菌能够继续运动固体表面（如珊瑚骨骼）。在Roseobacter中，广泛观察到游泳运动性，但没有报道群集运动性。游动和群集可能由三个进化相关鞭毛基因簇（FGCs）中的任何一个赋予，称为fla1、fla2和fla3。在七种Roseobacter中观察到了导致树突状表型的假定蹭行运动，但是遗传基础尚不清楚。

  除HKCCD7318外，所有clade-S成员都携带由36个基因组成的完整fla1基因（图5A）。相比之下，包含17个连续基因和flgI基因部分的两个DNA片段（表S4）在分支M成员中缺失（图5A），并且推断它们在clade-M的LCA中丢失了。这些丢失的基因参与鞭毛的多组分的组装，包括III型分泌系统的组分（flhA、flhB、fliQ和fliR）、P-和L-环（flgA和flgH）、运动蛋白（motB）、基体蛋白菌株HKCCD7318是clade-S成员的一个例外，也携带截短的fla1簇，但与clade-M成员相比，它包含5个以上编码Ⅲ型分泌系统组分和基体的基因（表S4，图5A）。我们的实验分析显示，具有完整fla1集合的clade-S成员（HKCCD5849和HKCCD7319）显示出比clade-M成员和HKCCD7318更大的泳圈，后者携带截短的fla1簇（图5B）。在所有受试中未观察到群集或蹭行运动（图5B）。先前对球形红细菌的研究表明，fla1簇的表达在厌氧条件下受到正向调节，这可能是该细菌对氧或替代电子受体（例如，DMSO和TMAO）对缺氧条件的气相催化反应的部分。这有助于解释为什么一些分支成员的完整fla1保持不变。如上所述，珊瑚骨架变得周期性缺氧，并且保持的运动性可以促进清除骨架中的氧和替代电子受体。

  图5 鞭毛基因fla1簇在由珊瑚和珊瑚分离物组成的扩大的Ruegeria种群中的系统发育分布和假基因特征非珊瑚海洋栖息地，以及选定分离株的运动试验。（A）在exp-clade-M和exp-clade-S成员中fla1簇的基因排列。粉色箭头表示clade-S特异性基因，灰色箭头表示分别由exp-clade-M和exp-clade-S共享的核心基因。假基因在箭头上用红色十字标记。（B）三个分枝杆菌菌株和三个分枝杆菌菌株的活力测定。在0.3% （w/v）水琼脂和0.6% （w/v）琼脂上分别测试游泳和群集运动性8天；蹭行运动在湿化盒中的1.0% （w/v）琼脂上测试10天。（C）基于44个菌株的Ruegeria群体的扩展基因组系统发育，包括从各种生态位收集的菌株。exp-clade-M、exp-clade-S和exp-outgroup从图1A中的clade-M、clade-S和外围群体扩展而来。节点处的实心圆表示分支的超快引导支持值为100%。比例尺表示每个站点的替换数量。使用由454株Ruegeria和相关菌株组成的更大的系统发育树（图S12）来确定树的根。含有完整fla1簇的菌株用黑盒标记。带有部分fla1簇的菌株是用白盒标记，exp-clade-M和exp-clade-S中不同类型的部分fla1簇用白盒中的数字区分。

  珊瑚礁生态系统在北方普遍较差。尿素主要来自浮游动物、鱼类和其他动物的排泄物，是珊瑚全生物体内珊瑚宿主、共生体和细菌的重要N源。

  。已知细菌的尿素分解通过增加土壤、河口、沿海海水、动物瘤胃和肠道等环境中的酸碱度和供给碳酸盐来促进钙化。在珊瑚骨骼中，钙化过程也可以通过尿分解得到加强。

  ）可能在clade-M的LCA中丢失（表S4）。此外，编码尿素水解脲酶的基因，是显示异常大的分支间

  值的核心基因的一部分。系统发育分析表明，clade-S或clade-M从不同的遗传来源获得等位基因，取决于组成基因（图S4对图S10）。这些结果表明，clade-S和clade-M在尿素分解上已经分化，并且clade-S可能显示出更高的潜力来利用这一功能，因为它保持了尿素吸收的转运体。在这种情况下，骨骼相关的成员对尿素矿化的遗传特征的保护可能有利于珊瑚宿主的钙化。

  有趣的是，我们的生长分析显示，在测试条件下，clade-S和clade-M成员在尿素上生长都很差，并且没有表现出不同的生长（图4A-11、461 4B-11和4B-12）。我们认为产生氮源，并不是

  种群使用尿素的主要目的。这是因为使用它的高能量成本，尿素可能不是细菌的优选氮源，特别是当珊瑚骨架富含溶解的无机氮时，其浓度超过周围海水。除了使用尿素作为氮源之外，细菌还受益于在酸性环境中存活的尿素分解和对宿主的趋化性，这是由酸暴露和镍（Ni）富集诱导的。然而，

  在目前的研究中没有筛选脲酶表达的环境诱导剂（即酸性酸碱度和高水平的镍），这可能解释了

  。我们假设骨架中的尿分解可能是对未检测到的环境诱导剂的有条件表达的功能，这可能同时增加珊瑚宿主的钙化效率。未来需要实验来验证这个假设。

  clade-S和clade-M之间的代谢差异提供了丰富的证据，表明这两个分支的多样化可能是由与不同珊瑚区室相关的异质性条件驱动的。然而，这两个分支的分裂时间估计为752万年前，表明clade-S和clade-M的分裂远远早于它们的宿主珊瑚的诞生，宿主珊瑚可能出现在几十年至一个世纪前。因此漫长的进化时间给clade-S和clade-M的起源留下了一个未解之谜：它们是在珊瑚上重新进化的，还是在它们定居在珊瑚宿主的不同部分之前就已经出现在其他环境中了？

  在前一种情况下，不同的隔层是直接推动物种形成的动力。细菌有机会在珊瑚上经历一段长时间的进化，甚至超过珊瑚的寿命，因为细菌可以在珊瑚世代之间垂直传播（图S11）。在这个模型中，clade-S和clade-M的LCA定殖于古珊瑚宿主，然后clade-S和clade-M通过代谢性状的获得或缺失开始分化，在各自适宜的区室随着珊瑚宿主的生长周期继续繁衍。一个区室中的优势细菌分支可能仍然能够在另一个区室中存活，因为它们在空间上是接近的，但是由于针对其自身的区室特定选择，它们的丰度相比来说较低。接下来，两个分支的成员都有机会与珊瑚配子和浮游生物一起传播，并在珊瑚新成员安顿下来并开始分泌粘液和发育骨骼后，在它们的最佳区室里茁壮成长。

  若第二个假设为线），不同的珊瑚室可能不是驱动clade-S和clade-M之间物种形成的初始力量。相反，这两个分支可能已经在其他环境中分化，并在整个进化过程中反复定居在珊瑚宿主的不同隔间。不同珊瑚室的环境异质性可能会对局部细菌施加不同的选择力，并丰富适应最好的分支成员，这反过来可能会加速两个分支的多样化。

  并由IQ-TREE v1.6.5构建的系统发育树。从不同珊瑚区室分离的菌株用不同的颜色。节点处的实心圆表示分支支持值≥ 80%。比例尺表示每个可变位点的单核苷酸多态性数量。（C-D）在两个子种群中产生100，000棵置换树中的每一棵所需的迁移数量的频率分布。蓝色箭头表示根据真实数据推断出的迁移数量。

  种群共生，但它们来自各种生态位，包括褐藻生态位（例如海水、沉积物和藻类组织）、红树林根际、沿海海水、潮间带沉积物和另一批针叶珊瑚样本（表S6）。根据最新的系统发育树（图5C），新增的菌株扩展了

  种群的所有三个主要分支（图5C）。扩展的clade-M （以下称为“exp- clade -M”）中的成员被平均划分为两个亚支，其中subclade -M1由粘液相关成员（相当于图1A中的clade-M）组成，而subclade -M2的成员组成，大多数来源于非珊瑚生态位（图5C）。这种模式阻止了我们推断Ep-clade-M的LCA栖息地。扩展的clade-S（以下简称 “exp-clade-S”）中的成员被不等分成两个亚纲，单个subclade -S2来自海水，subclade -S1由居住在珊瑚骨架和其他非珊瑚生态位的系统发育混合菌株组成（图5C）。我们不能确定exp-clade-S的LCA的栖息地。在扩大的外群分支的情况下，与珊瑚相关的菌株嵌入早期分支谱系中，该谱系不是来自珊瑚（图5C），这表明这个扩大的外群分支的LCA栖息地与珊瑚无关。

  sp. 6PALISEP08代表的单分支放在一起观察时，分离株的栖息地信息和系统发育树更符合这种假设，即原始骨架分支、粘液分支和外群分支（图5C）各自独立地从祖先定殖的非珊瑚栖息地进化而来的。

  由于原始clade-S和clade-M之间的分支发生事件可能在除珊瑚区室之外的生境中完成，分支间的一些差异在祖先血统独立过渡到珊瑚粘液和骨骼之前，代谢潜力可能已存在。因此，我们寻找证据来区分不同珊瑚区和非珊瑚区的代谢差异。简而言之，我们筛选了显示clade-M （或clade-S）特异性分布但在exp-clade-M（或exp-clade-S）中不流行的基因家族，因为这些基因的进化更有可能是由珊瑚区室驱动的。然后，我们基于44个菌株基因组的系统发育树推断了符合条件的基因家族的进化史（图5C）。

  这一新的分析显示，在扩展的系统发育中，上述clade-M特异性的渗透调节物质利用基因的一半以上是在M1分支的LCA获得的（表S7）。这些基因包括GPC摄取的

  。这证明了珊瑚粘液环境代表一种重要的选择性驱力，塑造了粘液相关细菌的基因组。然而，这种扩展分析使得对clade-M特异的剩余渗透物降解基因的进化与珊瑚粘液生境分离，因为这些基因在clade-M成员中普遍存在，并且大部分是在clade-M的生命周期评价中获得的（表S7）。类似地，扩展分析表明尿素转运蛋白基因、硫氧化基因以及富马酸盐和L-酒石酸盐呼吸作用基因的进化与珊瑚骨架栖息地不相关，因为这些基因通常在exp-clade-S成员中发现，并且在exp-clade-S的生命周期评价处获得或者在exp-clade-M的生命周期评价处缺失（表S8）。在I型鞭毛基因簇（

  ）包含18个基因的情况下，很难基于基因存在和缺失模式推断其进化史。尽管进化枝中的少数成员，包括大多数与骨骼相关的成员，拥有一整套基因，但是这个分支和exp-clade-M的所有成员各自包含基因的子集（图5）。在携带不完整

  的缺失部分相邻的基因大多被假基因化（图5A）。因为假基因化是持续基因缺失的明确遗传证据，

  缺失的部分更有可能是基因丢失的结果（表S8）。因此，在大多数与骨骼相关的成员中保存完整的

  对于Ruegeria种群，我们分析表明珊瑚宿主的不同部分可能作为不同的选择压力，驱动细菌基因组的进化和适应。然而，考虑到该种群中蕴藏着大量的遗传多样性，珊瑚宿主的不同区室是否也在不同区室定殖的细菌中充当基因流动的物理屏障仍是未知的。接下来，我们通过使用遗传上一致的Rhodobacteraceae种群调查了这个问题，该种群由214个分离株样本组成，这些分离株从相同珊瑚物种P. acuta的四个不同珊瑚个体中取样（表S6），每个分离株从香港的不同位置收集（图S1）。这个新的群体代表了一个不同于所有已知的Roseobacter成员的谱系（图S4），在16S rRNA基因上与其邻近物种-RhodobacteraceaebacteriumMA-7-27（基因库组件登记号：GCA_003688285.1）显示出97.7%的同一性。这个群体中的成员共享相同的16S rRNA基因，显示大约99.99%的成对ANI（表1），并且在214个成员共享的大约4.39 Mbp核心基因组序列中仅相差43个SNPs（表1）。基于单核苷酸多态性的系统发育树显示，分离株没有根据珊瑚区室或采样位置聚集（图S13）。分离株之间极高的遗传同一性表明，在过去几百年中，这个种群最近有起源分别是130年前的黄湾洲（WWC）和非政府组织美洲（NMC）的亚群。这可能跨越了香港水域的珊瑚动物的几代，因此提供了一个独特的机会来检测分散限制是否可能在驱动种群分化中起作用。

  Slatkin-Maddison检验旨在根据产生观察到的系统发育位置的迁移数量来测量区室化的程度（补充文本1.10）。通过假设密切相关的菌株的共同祖先占据了单个区室，当在不同的区室中发现密切相关的菌株时，可以推断出迁移事件。根据真实数据估计的迁移的数量大于通过在系统发育树中置换菌株从随机产生的种群结构计算的迁移的预期数量的小概率反映了高度的划分。WWC亚群（图6A）和NMC亚群（图6B）各由两个或多个室组成，因此有资格进行Slatkin-Maddison试验。该测试显示，在这亚群中，推测的迁移比偶然预期的少（WWC亚群中的29个迁移，p 0.01，图6C；NMC亚群中的12次迁移，p 0.001，图6D），表明来自同一个珊瑚个体不同部分的成员被划分为区室，微生物种群沿着珊瑚区室分化可能开始于从隔间之间的有限迁移。

  珊瑚宿主有许多物理化学性质不同的区室，包括营养质量和数量、能量来源和氧化还原水平等。在本文中，我们提供了第一个证据，证明这种异质性驱动了细菌的群体进化。在本文研究的两个Roseobacter群体中，一个（Rhodobacteraceae）在整个基因组中只有几个单核苷酸多态性位点不同，但在不同的区室中已经显示出分散限制，而另一个（Ruegeria亚群体）已经分化成在多种功能特征上不同的不同物种。对于后者，辅助基因组的基因增加和缺失以及核心基因组的新等位基因替换可能是驱动它们分化的潜在因素。而clade-M获得了新的基因，以利用粘液相关化合物（如甲胺和其他珊瑚渗透剂、碳水化合物和芳香剂），并使它们能够在数量众多的珊瑚粘液中与其他细菌竞争；clade-S保留了clade-M失去的代谢性状，如无机硫和一氧化碳的氧化、运动性和潜在的尿素分解，还获得了新的性状以区别于外围群落，外围群落对在骨骼中生存至关重要。尽管在珊瑚宿主定殖之前一些特征可能已多样化，但是包括运动性和粘液衍生化合物的利用在内的一些重要特征的分化表明骨骼和粘液环境可能是形成Ruegeria种群进化的重要驱力。

  先前的珊瑚微生物组研究成功地在群落结构水平上表征了珊瑚中Rhodobacteraceae成员的都会存在，但是每个谱系在珊瑚上的作用，更具体地说，在不同的珊瑚区室上的作用还没有被确定。群体基因组学是追踪特定谱系如何沿着不同珊瑚区室进化的强大工具，并为我们大家带来了细菌如何与珊瑚相互作用，这是由于分散限制和当地群体的适应性选择。通过利用群体基因组学，我们的分析提供了一个观点，即生态相关的Ruegeria群体的进化是由不同珊瑚区室的特定外因驱动的。一些适应策略是细菌和珊瑚宿主的双赢选择。例如，clade-M成员可以去除珊瑚粘液中的一些潜在有毒的芳烃，clade-S成员具有分解尿素的遗传潜力，这可能通过在环境酸化时促进骨架的钙化而给珊瑚宿主带来益处。这些预测，如果得到证实，将是进一步了解细菌-珊瑚群落互作的基础，并将通过更仔细地考虑细菌在维持珊瑚生物健康中的作用，帮助改进我们的珊瑚保护策略。